【CoE板块】双重核内指标探索CD4+Treg细胞亚群

Treg细胞的免疫学背景

胸腺来源的调节性T细胞（Treg）是一类具备免疫抑制作用的T细胞亚群，其在维持组织稳态、调节自身耐受性方面具有关键作用，一些疾病如系统性红斑狼疮、慢性感染和癌症等的发生，都与Treg细胞数量或功能改变有关，因此，Treg细胞往往是与免疫抑制机制相关的疾病研究中的关键对象。然而，常用的CD4、CD25、Foxp3这些基础标志物，在某些研究上难以准确鉴定Treg细胞的亚群以及追溯其来源。有早期报道曾指出，在人体中，由于体内外周抗原暴露，Foxp3也能在常规 T 细胞中被激活表达，参与外周炎症部位的免疫抑制过程，至此，有关treg细胞的来源被认为既可源于胸腺内（tTregs），也可源于胸腺外（pTregs）。^[1]

图1：tTregs 和 pTregs 的生成和功能发挥^[1]

Helios在区分不同来源Treg细胞的重要应用

Helios是Ikaros转录因子家族成员之一。Ikaros转录因子家族是一组在免疫系统和造血系统中发挥关键作用的锌指转录因子，主要包括Ikaros、Aiolos、Helios、Eos和Pegasus五个成员。这些成员在淋巴细胞及其他造血细胞的早期发生、发育以及功能的正常发挥中必不可。有研究报道，其利用一系列小鼠实验追踪Helios在T细胞不同生长阶段的表达情况，发现Helios的表达早于Foxp3，且体内胸腺来源的Treg细胞均表达；而在体内外周环境中因抗原刺激产生的外周Treg细胞群体，在小鼠中约有70%表达Helios（该比例在后来人类队列中也发现类似）^[2]。另一方面，Helios与Treg细胞状态稳定性存在一定的关联。据文献资料显示，在体外扩增的敲除了Helios基因的人记忆Treg细胞，在炎症环境下的抑制功能和稳定性与未做基因敲除处理的Treg细胞相当，因此，Helios高表达与Treg细胞稳定性提高有关，但并非是直接驱动稳定的关键因素^[3]。

关于Helios的功能发挥在多种疾病中已获得印证。例如，在系统性红斑狼疮（SLE）患者中，病症严重程度更高的患者PBMC样本中，具更高比例的Helios+Foxp3+Treg细胞，并未因体内存在的IL-2、IFN-γ因子而导致数量减少。在癌症研究中，有关乳腺癌的文献报道显示，Helios+Foxp3+Treg细胞在肿瘤微环境中积累，其与不同免疫抑制分子共同产生的抑制作用可能对乳腺癌的预后造成不良影响。可见，研究Treg细胞增加Helios指标的重要意义。

图2：Helios与Treg细胞稳定性的关系 ^[3]

多色panel区分CD4+Treg细胞亚群

这里为大家介绍一篇应用Helios、Foxp3双重核内指标对CD4+Treg细胞细分亚群的文献内容，panel设计来自OMIP-053 ^[4]。OMIPs（Optimized Multicolor Immunofluorescence Panels）系列是一套经过充分测试和验证，旨在为研究人员提供标准化抗体和试剂组合方案的多色免疫荧光面板，在开展多色流式方案设计时具有较高的参考意义。该文献中，主要应用了CD3、CD4、CD25、CD45RA、CD127、Foxp3和Helios作为鉴定CD4+Treg细胞亚群的核内染色组合，附加Ki67、CCR7、CD38、HLA-DR、CD39的标志物观测细胞的免疫状态，具体分析逻辑详见下方流式图，其中附上该文对TDP1-3和SE 1-3的定义逻辑：

图3：人 CD4+Treg细胞的鉴定、分类和分析 ^[4]

CoE实验中心实测数据

在了解Helios对Treg细胞分类的意义后，CoE实验中心也实测了小鼠脾脏组织中Helios和Foxp3的表达情况。如下图所示，在CD4+T细胞中，可以清晰看到CD25^hi/FoxP3^pos细胞群体，同时通过Helios和Foxp3双通道能有效圈出Helios^posFoxp3^pos双阳性，代表胸腺来源的Treg（tTreg），以及Helios^negFoxp3^pos单阳性，代表外周来源的Treg（pTreg）。

图4：野生型小鼠脾脏组织样本中Treg细胞表达情况【CoE中心内部实测数据】

所用试剂列表

相信以上分享的知识点能加深大家对Treg亚群的认识，有关更多的知识点扩充和实验复现，欢迎持续关注【CoE板块】哦~

参考文献

1.     Yadav M, Stephan S, Bluestone JA. Peripherally induced tregs -role in immune homeostasis and autoimmunity. Front Immunol.2013;4:232.

2.     Thornton AM, Korty PE, Tran DQ, et al. Expression of Helios, anIkaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived fromperipherally induced Foxp3+ T regulatory cells. J Immunol.2010;184(7):3433-3441

3.      Lam AJ, UdayP, Gillies JK, Levings MK. Helios is a marker, not a driver, of human Tregstability. Eur J Immunol. 2022;52(1):75-84.

4.      Nowatzky J, Stagnar C, Manches O.OMIP-053: Identification, Classification, and Isolation of Major FoxP3Expressing Human CD4⁺ Treg Subsets. Cytometry A.2019;95(3):264-267.