【CoE板块】线粒体成像必看Mito-Tracker Green：活细胞标记神器，膜电位不敏感！
细胞线粒体的数量或形态的变化通常与代谢调节、病理状况以及细胞凋亡有关。而用于研究线粒体含量及动态变化的外源性荧光探针高度依赖于线粒体膜电位，这限制了测量结果的可靠性，因此不依赖于线粒体膜电位的Mito-Tracker Green更适用于检测线粒体质量。
线粒体自噬和线粒体生成的失调，以及由此导致的线粒体质量的变化，都与许多病理状况有关。因此对线粒体质量的评估，对于了解细胞病理状况的机制具有至关重要的意义。因为线粒体作为细胞的“能量工厂”和代谢调控中心，其功能状态直接影响细胞的健康、疾病发生以及衰老进程。因此检测线粒体质量具有如下重要意义：
(1)评估细胞能量代谢状态：线粒体是ATP的主要生产者，线粒体质量（如结构完整性、膜电位、呼吸链效率等）直接反映细胞的能量代谢能力；
(2)揭示疾病发生机制：线粒体功能障碍是多种疾病如神经退行性疾病、心血管疾病、遗传性线粒体病等的共同特征，通过检测线粒体质量可帮助明确疾病分子机制；
(3)监测细胞应激与凋亡：线粒体是细胞凋亡（程序性死亡）的关键调控者，线粒体膜电位崩溃、通透性转换孔开放等是细胞凋亡的早期标志；
(4)研究衰老与寿命调控：通过干预线粒体质量（如激活自噬、抗氧化），可能延缓衰老进程；
(5)运动与健康研究：运动可增强线粒体生物合成（如激活PGC-1α通路），改善线粒体质量和数量；
(6)诊断线粒体相关疾病。
线粒体质量检测是了解细胞代谢、疾病机制和衰老过程的重要工具，对基础研究、临床诊断和治疗策略开发具有关键价值。尤其在代谢性疾病、神经退行性疾病和抗衰老领域，针对线粒体的干预已成为前沿研究方向。
Mito-Tracker Green是一种线粒体特异性绿色荧光探针，可用于活细胞线粒体特异性荧光染色。其为采用羰花青（carbocyanine）进行荧光标记的一种Mito-Tracker，和Mito-TrackerDeep Red 633、Mito-TrackerDeep Red FM、Rhodamine123或JC-1相比，Mito-TrackerGreen对于线粒体的染色不依赖于线粒体膜电位。
由于Mito-TrackerGreen对于线粒体的染色不依赖于线粒体膜电位，因此可对固定后的细胞或组织进行染色，但荧光可能会有一定程度的下降或弥散。Mito-TrackerGreen对活细胞的染色效果参考图1，对活细胞染色后应立即进行观察或检测，因为染色后再固定会导致荧光消失。
图1 Mito-TrackerGreen对于NRK-52E细胞(大鼠肾小管上皮细胞)的染色效果
注：Mito-Tracker Green染色的NRK-52E活细胞线粒体呈现绿色荧光(图B)，Lyso-TrackerRed(C1046)染色的NRK-52E细胞的溶酶体呈现红色荧光(图C)，绿色荧光、红色荧光及细胞核蓝色荧光的叠加效果见图D。其中细胞核使用Hoechst 33342(C1027)染色。本图仅作参考，实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异。
Mito-Tracker Green的最大激发波长为490nm，最大发射波长为516nm，呈绿色荧光，所以可在FITC通道中检测到。Mito-Tracker Green的结构式以及激发光谱和发射光谱参考图2。
图2 Mito-Tracker Green的结构式(左)以及激发光谱和发射光谱(右)
了解了Mito-Tracker Green的基础信息后，便来看看它的流式检测实例吧！
Mito-Tracker Green浓度滴定
1. 配制Mito-Tracker Green（1mM）储存液
a. 将Mito-TrackerGreen平衡至室温；
b. 用掌上离心机离心5分钟；
c. 加74uL DMSO溶解；
d. 每管5 uL分装，-20℃保存。
2. 倍比稀释Mito-Tracker Green（1mM）
MTG(1:50) | MTG(1:100) | MTG(1:200) | MTG(1:400) |
1uL MTG(1mM) | 10uL MTG(1:50) | 10uL MTG(1:100) | 10uL MTG(1:200) |
49uL Mito检测缓冲液 | 10uL Mito检测缓冲液 | 10uL Mito检测缓冲液 | 10uL Mito检测缓冲液 |
3. 用Jurkat细胞滴定Mito-Tracker Green
a. 分别取1.5x105个细胞至4个1.5mLEP管中，做好标记；
b. 加1mL 预冷的CellStaining Buffer，掌上离心机离心5min，吸弃上清；
c. 按下表加入相应试剂：
管号 | MTG(1:50) | MTG(1:100) | MTG(1:200) | MTG(1:400) |
Annexin V Binding Buffer | 100uL | 100uL | 100uL | 100uL |
Mito-Tracker Green | 1uL MTG(1:50) | 1uL MTG(1:100) | 1uL MTG(1:200) | 1uL MTG(1:400) |
d. 室温、避光孵育30min；
e. 加200uLAnnexin V Binding Buffer上机检测；
f. 实验结果如下：
（数据来源：达科为CoE实验培训中心实测）
g. 实验结论：从染色效果及节约试剂角度来看，Mito-Tracker Green的工作浓度可选1:100。
同时检测样本中的Mito-TrackerGreen和Mito-Tracker Deep Red 633
1. 取未刺激的Jurkat细胞、喜树碱（10uM）刺激7.5h的Jurkat细胞、在细胞培养箱中静置32h的小鼠脾细胞各1.5x105个至1.5mL EP管中，做好标记；
2. 加1mL预冷的Cell Staining Buffer，用掌上离心机离心5min，吸弃上清；
3. 加1mL预冷的Cell Staining Buffer，用掌上离心机离心5min，吸弃上清；
4. 加95uLAnnexin V Binding Buffer，此时细胞浓度约为1x105/100uL；
5. 按下表加入相应试剂：
试剂 | 用量 |
Annexin V-PE | 5uL |
MTG(1:100) | 1uL |
MT633(1:16) | 1uL |
6. 室温、避光孵育30min；
7. 加200uL Annexin V BindingBuffer上机检测；
8. 实验结果如下：
a. 未刺激的Jurkat细胞
b. 喜树碱（10uM）刺激7.5h的Jurkat细胞
c. 在细胞培养箱中静置32h的小鼠脾细胞
（数据来源：达科为CoE实验培训中心实测）
注：Annexin V+/Mito-Tracker Green+为凋亡早期，线粒体未崩解；Annexin V+/Mito-Tracker Green-为凋亡晚期，线粒体解体。
以上就是今天为大家带来的关于Mito-Tracker Green的相关内容，如有更多想法和建议，欢迎大家后台评论交流呀~
所用产品列表
品牌 | 产品货号 | 产品名称 | 产品规格 |
碧云天 | C1048 | Mito-Tracker Green (线粒体绿色荧光探针) | 50 μg |
碧云天 | C1073S | 活细胞Caspase-3活性与线粒体膜电位检测试剂盒 | 20 tests |
BioLegend | 420201 | Cell Staining Buffer | 500 mL |
BioLegend | 422201 | Annexin V Binding Buffer | 100 mL |
BioLegend | 640908 | PE Annexin V | 100 tests |
参考资料
网址
https://www.beyotime.com/product/C1048.htm
文献
[1] Anna C, Gianluca S, et al. MitochondrialMass Assessment in a Selected Cell Line under Different MetabolicConditions[J]. Cells, 2019, 8(11):1454.