【CoE实验方案】告别漏诊：高敏流式细胞术重塑PNH诊断金标准

阵发性睡眠性血红蛋白尿症（ParoxysmalNocturnal Hemoglobinuria, PNH）是一种罕见的获得性造血干细胞克隆性疾病，属于溶血性贫血范畴。其核心病理机制为磷脂酰肌醇聚糖A（PIG-A）基因突变，导致细胞膜表面糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白缺失，使血细胞对补体介导的溶解作用异常敏感，从而引发慢性血管内溶血、血栓形成及骨髓衰竭。

在临床上，PNH有以下分型：1）经典型PNH：显著溶血和血栓，骨髓造血功能正常；2）PNH合并骨髓衰竭：常与再生障碍性贫血或低增生性骨髓相关；3）亚临床PNH：微小克隆（<1%），无症状但需监测。

因此在诊断时，国际PNH工作组对于有临床溶血证据的患者（经典PNH和PNH/再障），建议使用流式细胞术分析红细胞和粒细胞；而对于无临床溶血证据的再生障碍性贫血或难治性贫血-MDS患者，建议使用高敏流式细胞术分析红细胞和粒细胞。

熟悉了PNH的相关基础知识后，便来看看PNH的诊断实例吧！

白细胞分析

在白细胞中检测PNH被认为是评估PNH克隆真实大小的最佳方法，其中粒细胞必检，单核细胞用于确认，两者的PNH克隆大小应该一致。

由于FLAER（fluo-rescentaerolysin）可与GPI锚定蛋白特异性结合，检测PNH克隆的灵敏度高，可能是检测白细胞PNH克隆最有用的试剂；但FLAER不能用于检测红细胞，因为其不能与人的红细胞很好地结合。

白细胞分析实验步骤

1）取流式管，加50uL待检测抗凝全血；

2）Fc受体封闭：加2.5uL Human TruStain FcX™，vortex混匀，室温孵育10min；

3）表面染色：按下表加入相应抗体，混匀，室温避光孵育15min；

4）裂红：加入1mL RBC Lysis/Fixation Solution (1X)，Vortex混匀，室温避光孵育10min；

5）350g离心5min，弃上清；

6）加2mL Cell Staining Buffer，350g离心5min，弃上清；

7）加500uL Cell Staining Buffer重悬，流式上机检测。

白细胞分析实验结果

1）PNH患者血样

2）正常人血样

     （数据来源：达科为CoE实验培训中心实测）

注:1)分析白细胞时，用系别markers设门来提高粒细胞(CD15)和单核细胞(CD64或CD33)的检测纯度和灵敏度；2)必须用至少两个GPI锚定蛋白检测PNH克隆,GPI锚定蛋白双阴性群即为PNH克隆；其中CD24是在粒细胞表面表达的GPI锚定蛋白,CD14是在单核细胞表面高表达的GPI锚定蛋白。

红细胞分析

目的是区分和定量III型、II型和I型红细胞；在分析时洗涤很重要，因为洗涤可以降低非特异性染色、去除多余的荧光素以及减少红细胞聚集，便于区分III型和II型红细胞。

在常规检验时不建议单独分析红细胞，因为溶血和输血可能会大大低估PNH克隆的大小；而在分析白细胞时发现PNH克隆后须检测红细胞。分析白细胞时可见一个PNH克隆，但分析红细胞时可见三型红细胞，其中红细胞PNH克隆大小为III型与II型红细胞的比例加和。由于红细胞PNH克隆的寿命缩短，以及输血和血管内溶血，会使得红细胞的PNH克隆经常小于粒细胞和单核细胞。

红细胞分析实验步骤

1）在流式管中，用1mL Cell Staining Buffer稀释5 uL待检测抗凝全血；

2）转移100uL稀释后的全血至新的流式管中，加入推荐量的表面检测抗体；

3）室温避光孵育20min；

4）加2mL Cell Staining Buffer，350g离心5min，弃上清；

5）加500uL Cell Staining Buffer重悬，流式上机检测。

红细胞分析实验结果

上述同一PNH患者血样

（数据来源：达科为CoE实验培训中心实测）

注:1)CD235a是血型糖蛋白A家族的成员,血型糖蛋白A由红系前体和红细胞表达，因此CD235a可用于选定红细胞；2)CD59是一种糖基化磷脂酰肌醇（GPI）锚定糖蛋白,广泛表达于造血细胞，可用于区分不同分型的红细胞：II型红细胞是CD59部分缺失、III型红细胞是CD59完全缺失。

以上就是今天为大家带来的关于PNH流式检测的实验内容，如有更多想法和建议，欢迎大家后台评论交流呀~

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参考文献

[1]Peter C, Omine M, et al.Diagnosis andmanagement of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria[J]. Blood, 2005, 106(12):3699-709.

[2]Borowitz MJ, Craig FE, et al. Guidelines for thediagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and relateddisorders by flow cytometry[J]. Cytometry B Clin Cytom, 2010, 78(4):211-30.