【CoE实验方案】悟空也逃不过的“五指山”—CFSE检测T细胞增殖

细胞增殖是指细胞分裂（细胞质分裂）引起的细胞数量增加，是细胞周期的最后一步，所以细胞增殖在生命周期中对于正常组织的发育和维持是必须的。测量细胞增殖的两种最常见方法包括细胞周期分析和增殖分析，今天小编为大家介绍的便是用于细胞增殖分析的CFSE（Carboxyfluoresceindiacetate succinimidyl ester，羧基荧光素二醋酸琥珀酰亚胺酯）检测试剂。

CFSE是一种可标记活细胞的荧光染料，其基本原理如下：CFSE的前体CFDA-SE是没有荧光的，可直接透过细胞膜进入细胞，一旦进入细胞，其乙酸基团会被胞内酯酶水解，产生具有绿色荧光的CFSE，且不容易释放到细胞外，可长时间存在于细胞内。在细胞分裂增殖的过程中，CFSE的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此子代细胞的荧光强度是亲代细胞的一半，从而可轻松使用流式细胞术检测细胞增殖情况。

鉴于上述CFSE的特点，其常被用于淋巴细胞的增殖检测，今天便来一起学习CFSE检测T细胞增殖的步骤吧！

PBMC制备

1. 用人外周血淋巴细胞分离管从肝素抗凝血中分离出PBMC；

2. 吸取PBMC至一个15mL离心管中；

3. 加入适量无菌PBS，350g x 5min，弃上清；重复洗涤一次；

   注:要彻底洗去血清，以免影响CFSE的标记。

4. 计数，用无菌PBS将细胞浓度调整至5x10⁷/mL；

   注:细胞浓度范围为1-10x10⁷/mL；如果细胞浓度低于1x10⁷/mL，则需在PBS中加入5% FBS，然后再进行CFSE标记，以降低CFSE的细胞毒性。

CFSE贮存液和工作液配制

5. CFSE贮存液(5mM)配制：

Ø   取CFSE试剂盒中的1管(100ug CFSE)，复温至室温；

Ø   离心，使冻干粉集中于管底；

Ø   加入36uL无水DMSO，直至完全溶解，配成5mM的贮存液;

Ø   立即使用，剩余部分如下分装冻存：

每管10uL分装，干燥避光、-20℃保存不超6个月(最好放干燥剂)，避免反复冻融；

注:因CFSE可与水反应发生酯水解，所以CFSE溶液不能长时间储存，且不能受潮。

6. 2X CFSE工作液的配制：

CFSE标记

7. 按下表加细胞和CFSE(2X)工作液于15mL无菌离心管中，并立即涡旋混匀；

8. 37℃孵育20 min；

注:CFSE可在几分钟内标记完成；如标记时间过长，CFSE的毒性会影响细胞的增殖，尤其当细胞浓度较低且无缓冲蛋白时。

9. 各加2mL 1640完全培养基(含10% FBS)，室温或37℃孵育5 min，以终止标记；

注:也可用等体积的FBS来终止标记。

10. 350g x 5min，弃上清；用培养基重复洗涤一次；

11. 计数，用1640完全培养基(含10% FBS)将细胞浓度调整至1 x 10⁶/mL；

CFSE标记效果的检测

Ø   未标记和不同浓度CFSE标记后的细胞各取100uL，约1 x 10⁵个细胞；

Ø   加200uL PBS，流式上机检测。

PHA-P(2X)工作液(20ug/mL)配制

Ø   用1640完全培养基稀释PHA-P母液(1mg/mL)，配制足量的2X工作液；

   注:剩余的PHA-P(2X)保存于4℃，后续可能用于换液；但实际上可不用换液。

细胞刺激和流式检测

12. 按下表用PHA-P刺激细胞：

13. 流式检测：

Ø   按上表在相应天数吸出孔中部分细胞至流式管；

Ø   加200uL PBS，流式上机检测；增殖效果好，可再进行表面抗原(CD3/CD4/CD8)染色。

结果展示（来源：行健雅CoE实验培训中心实测数据）

Ø   CFSE标记效果的检测：

检测结果：

   d4检测结果：

   d5检测结果：

以上就是今天为大家带来的关于CFSE检测T细胞增殖的实验内容，如有更多想法和建议，欢迎大家后台评论交流呀~

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